A Phytophthora cinnamomi (fitóftora) precisa de água para desenvolver o seu ciclo biológico pelo que o teor de humidade e temperatura do solo é fundamental para o seu estabelecimento, dispersão e sobrevivência. De facto, em presença de água livre no solo a fitóftora desenvolve estruturas assexuadas (esporângios) que produzem esporos móveis (zoósporos) que são atraídos para as raízes jovens e finas das árvores. Os esporos invadem os tecidos vasculares das raízes que são os responsáveis pela captação e transporte de água e nutrientes nas plantas. Ao ficarem inoperacionais, as raízes comprometem o abastecimento de água e nutrientes às copas, que começarám, sobretudo na parte superior, a mostrar sintomas progressivos de perda de vitalidade como a alteração de cor das folhas pasando da verde-scuro a amarelo e castanho e a desfoliação (copas mais transparentes).
Portanto, a fim de identificar a presença de fitóftora no laboratório, os técnicos necessitam de amostras de solo e raízes recolhidas após um período de chuva. A identificação e isolamento da fitoftora no laboratório segue um protocolo preciso que é esquematizado e descrito na figura e texto abaixo.
As amostras de solo foram recolhidas à volta de sobreiros e azinheiras (Painel 1. A) suspeitos de infeção por Phytophthora cinnamomi (Painel 1. A). Foram igualmente recolhidas folhas de árvores (sobreiros) saudáveis (Painel 1.B) para serem usadas como isco nos ensaios de identificação em laboratório.
As amostras de solo foram refrigeradas a 4C e trazidas para o laboratório. Para homogeneização, cada amostras foi misturada, limpa de pedras e detritos antes de ser colocada em caixas plásticas (25 cm x 20 cm x 18 cm): 1 parte de solo para 2 partes de água destilada. A mistura foi ainda limpa de forma a remover quaisquer detritos ou matéria orgânica flutuante à superfície. As folhas esterilizadas (iscos) foram colocadas à superfície na caixa (Painel 2) e incubadas à temperatura ambiente. Como controle para a sanidade das folhas usadas como isco, as folhas foram igualmente colocadas em uma caixa plástica apenas com água (Painel 2.C).
Os sintomas nas folhas foram avaliados visual e microscopicamente (Painel 3) e os que apresentavam sintomas semelhantes a Phytophthora sp. foram colocados em meio PARPH semi-seletivo (Painel 4) e eventualmente repicados em um meio PDA (Painel 5) e as hifas observadas ao microscópio (Painel 5.B). Uma vez que as amostras de fungos se encontravam puras, o DNA genómico foi extraído (Painel 6.) e a realizou-se a análise molecular (Painel 7). Para tal, foram feitos PCRs com oligos específicos para um internal transcribed spacer (sigla em inglés, ITS), região existente em todos os fungos, bem como com oligos específicos para o gene LPV3 que amplificam um gene específico para Phytophthora cinnamomi (Painel 7.A; gel superior e inferior respetivamente). Para confirmar a identificação, os produtos de PCR foram enviados para sequenciação (Painel 7.B) e sua sequência submetida a bancos de dados publicamente disponíveis, de forma a permitir determinar a identidade exata dos fungos isolados (Painel 7.C).
Das 12 amostras de solo analisadas no laboratório do InPP apenas duas mostraram ter Phytophthora cinnamomi, precisamente nos sítios portugueses de Ourique e Avis. Da mesma forma, apenas duas amostras de solo analisadas pelo CICYTEX mostraram a presença de fitóftora em Alcuescar.
Este projeto é financiado no quadro do Promove – O Futuro do Interior, programa da Fundação “la Caixa” lançado em parceria com o BPI e a Fundação para a Ciência e a Tecnologia, com o objetivo de apoiar iniciativas inovadoras em domínios estratégicos para o desenvolvimento das regiões do Interior de Portugal.
